Na biologia molecular, a boa escolha de tampão e a preparação para diferentes etapas de isolamento do DNA podem ser a diferença entre passar para a expressão proteica ou abrir outro kit maxi-prep para recomeçar. Apesar de sua importância crucial, receitas de buffer são muitas vezes apenas isso - receitas escritas sem explicação ou lógica para os diferentes componentes. Um desses tampões é o tampão glicose tris-EDTA ou GTE.
$config[code] not foundO que é usado para GTE?
O GTE é usado para ressuspender os pellets de células bacterianas antes de lisar (abrir as células) e coletar o DNA do plasmídeo dentro. A lisozima, que suaviza as membranas celulares, é frequentemente adicionada junto com o tampão GTE. Conseguir uma suspensão homogênea de células inteiras durante esta etapa, de modo que a solução de lise adicionada subsequentemente possa chegar a todas as células, é fundamental para obter bons rendimentos de DNA. O GTE foi projetado para fazer isso ao mesmo tempo em que fornece um ambiente estável para o DNA.
Glicose para osmolaridade
Adiciona-se açúcar glicose 50 mM (milimolar) ao tampão GTE para manter a osmolaridade, onde a concentração de soluto fora das células é próxima daquela dentro das células. Isso evita a lise celular prematura, que pode causar menores rendimentos de DNA devido à agregação e degradação. Os outros componentes do tampão também contribuem para a osmolaridade da solução, mas a glicose, sendo um não-eletrólito, é uma boa escolha porque não interfere nas propriedades do tampão da solução.
Tris para estabilidade de pH
Tris é o nome abreviado de tris (hidroximetil) aminometano, que é um tampão de pH muito comum. No caso do tampão GTE, o sal ácido (Tris-HCl) é adicionado ao tampão a uma concentração de 25 mM. Isto mantém o pH da solução a um pH quase fisiológico de 8,0, um pH ideal para prevenir a hidrólise ácida (degradação) do ADN plasmídico e reacções secundárias indesejadas dos outros componentes celulares.
EDTA Previne a Degradação do DNA
O EDTA, ou ácido etilenodiaminotetracético, captura ou "quelatos" os íons metálicos da solução, impedindo-os de participar de reações colaterais indesejadas. Em tampão GTE, o EDTA é adicionado a 10mM. Sua finalidade principal é o buffer para arredondar o zinco, o magnésio e o cálcio livres, evitando assim a degradação do DNA por certas vias que requerem esses metais.
Algumas dicas importantes
Mantenha o seu tampão GTE frio e faça-o em pequenas quantidades para evitar o crescimento de bactérias não intencionais nele. O açúcar e o pH controlado são um ótimo meio de crescimento. Sempre use água purificada. A água da torneira pode ter um excesso de íons de metal dos tubos, o que pode sobrecarregar a capacidade do EDTA de capturar. Se você suspeitar da presença de RNA interferente em sua amostra, adicione RNase A a 100 microgramas por mililitro ao seu tampão GTE para eliminar o problema.
